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遺傳毒性試驗

遺傳毒性試驗是用來檢測化學物質對遺傳物質的毒性作用的實驗方法，主要包括基因突變和染色體畸變等檢測。這些實驗方法可以評估化學物質對DNA和染色體的損傷程度，從而預測其可能對人體造成的遺傳毒性風險。在實驗過程中，需要使用標準化試驗方法，遵循GLP原則，以保證實驗結果的準確性和可靠性。遺傳毒性試驗對于評估化學物質的致癌性和致畸性具有重要意義，可以為化學品的安全性評估和風險評估提供依據。

遺傳毒性試驗的目的和意義如下：

目的：

1、檢測化學物質對遺傳物質的毒性作用，評估其可能對人體造成的遺傳毒性風險。

2、預測化學物質可能導致的基因突變和染色體畸變等遺傳學損傷。

意義：

1、評估化學物質的致癌性和致畸性，為化學品的安全性評估和風險評估提供依據。

2、預測化學物質可能對生殖細胞產生的非整倍體潛在性，為生殖健康和人類遺傳學的風險評估提供依據。

3、為制定人類接觸化學物質的限制劑量提供科學依據，以保護人體健康和安全。

細菌回復突變試驗：

1.取營養肉湯培養基5mL，加入無菌小三角瓶或無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養物接種于營養肉湯培養基內，在（37±1）℃、（115r/min～125 r/min）振蕩培養10h～12h至對數生長期，活菌數不少于1×10⁹cfu/mL。融化頂層培養基分裝于無菌小試管，每管2mL，在45℃水浴中保溫。

2.在保溫的頂層培養基中依次加入樣品液0.1ml、新鮮細菌培養物0.1ml和10%S9混合液0.5mL。無活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。試管內容物混合后鋪至最低瓊脂營養平板的表面。在培養前待頂層瓊脂固化。樣品組分別設三個平行皿。

3. 陰性對照組分別加入0.1mL浸提介質和新鮮細菌培養物0.1ml，活化組再加10%S9混合液0.5mL，無活化組加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL；陽性對照組分別加入誘變劑0.1mL和新鮮細菌培養物0.1ml，活化組再加10% S9混合液0.5mL，無活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。陰性及陽性對照組分別設三個平行皿。全部平皿置37℃倒置培養48～72h觀察結果。

體外哺乳動物染色體畸變試驗：

1、試驗分為短期接觸組（有和無代謝活化系統）和長期接觸組（無代謝活化系統）。短期接觸組接觸4h，長期接觸組接觸24h。

2.接觸處理：試驗前接種一定數量細胞，置于二氧化碳培養箱培養。一天后棄培養液，0.9%氯化鈉注射液組加入對照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時，需用培養液補足）以及培養液。0.9%氯化鈉注射液浸提液的終濃度為10%。含血清培養基組加入對照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時，需用培養液補足）。全部置于37℃二氧化碳培養箱中。短期接觸組接觸結束后吸去培養皿中的液體，用PBS清洗細胞3次，加入含血清培養基繼續培養。于24h內收獲細胞，收獲前4h加入終濃度為1μg/mL秋水仙素。陰性對照組和陽性對照組同法制備。

3.收獲細胞與制片：消化細胞后加含血清培養液收集細胞。加入0.075mol/L氯化鉀溶液低滲處理后，加入固定液（甲醇：冰醋酸，3:1混合）進行固定，固定結束后離心棄上清，加入數滴新鮮固定液滴片，空氣干燥后用姬姆薩染液染色。

4.結果評價：在光學顯微鏡下每一試驗組選擇300個分散良好的中期分裂相細胞進行染色體畸變分析，記錄畸變細胞數。

小鼠淋巴瘤細胞（TK）基因突變試驗：

1、 接觸處理：取生長良好的細胞，調整密度為1×10⁶/mL，無活化系統組取10mL細胞懸液與9mL試驗或對照樣品以及150mmol/L氯化鉀溶液1mL混合；有活化系統組取10mL細胞懸液，加入9mL試驗或對照樣品以及S9混合液，37℃震搖處理4小時（有和無活化系統）和24小時（無活化系統）。振蕩頻率為（70～80）r/min。處理結束后離心，棄上清液，用PBS 或不含血清的培養基洗滌細胞2 遍，重新懸浮細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液中，并調整細胞密度為2×10⁵/mL。

2. PE₀平板：PE₀（0 天的平板接種效率）測定：取適量細胞懸液，作梯度稀釋至8 個細胞/mL，接種96 孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6 個細胞/孔），每個劑量作2塊板，37℃，5% CO₂，飽和濕度條件下培養12d，計數每塊平板有集落生長的孔數。

3. PE₂平板：第2d表達培養結束后，按PE₀接種。每天計數細胞密度并保持密度在10⁶/mL 以下。

4. TEF拮抗平板：第2d 表達培養結束后，取適量細胞懸液，調整細胞密度為1×10⁴/mL，加入TFT（三氟胸苷，終濃度為3μg/mL），混勻，接種96 孔板（每孔加0.2 mL，即平均2000 個細胞/孔），每個劑量作2塊板，37℃，5% CO₂，飽和濕度條件下培養12d，計數有突變集落生長的孔數。

5. 結果評價：對每塊平板計算無集落生長的孔數，對TFT抗性拮抗平板應計算無小集落孔數、無集落孔數。每個劑量組數據求平均數，

哺乳動物骨髓紅細胞微核試驗：

1.選用50只體重在25～30g范圍內的SPF級KM小鼠，分為5組，每個劑量組10只，雌雄各半。

2. 動物染毒采用兩次腹腔注射或尾靜脈注射，連續2d，即兩次染毒間隔24h，第二次染毒后6h取材。注射量為20mL/kg。

3. 用頸椎脫臼法處死動物，取出股骨。剔除肌肉等組織，擦凈血污。剪去股骨兩端，暴露骨髓腔。

4. 用注射器吸取0.1mL胎牛血清，沖洗骨髓腔。用沖洗液常規涂片，晾干或烘干。

5. 將干燥的涂片放入甲醇中固定5～10min，將固定過的涂片放入Giemsa 應用液（1份Giemsa儲存液：6份1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液混合而成,臨用現配），染色10～15min，然后用pH6.8 PBS液沖洗，晾干。

6. 在油鏡下觀察觀察計數含微核的嗜多染紅細胞（PCE）數以及觀察PCE/NCE（寫好標簽成熟紅細胞）的比例。每只動物計數1000個PCE，計算微核細胞率，以千分率表示。試驗數據用泊松分布方法進行統計學處理。同時，計數200個PCE，并記數所見到的NCE。

7. 陽性與陰性對照組的操作程序同供試品組。