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體外細胞毒性

體外細胞毒性試驗是一種在離體狀態下模擬生物體生長環境，檢測醫療器械及生物材料接觸機體組織后所發生的細胞溶解、抑制細胞生長和其他毒性作用的體外試驗。

體外細胞毒性試驗是醫療器械生物學評價體系中最重要的檢測指標之一，幾乎也是醫療器械及生物材料臨床應用前的必選項目。

體外細胞毒性試驗目的和意義:

　　目的：評級醫療器械和生物材料致細胞毒性反應的潛在性，并預測最終生物體應用時的組織細胞反應。通過體外細胞培養技術，可檢測供試品接觸細胞后細胞發生生長抑制、功能改變、細胞溶解、死亡或其他毒性反應。

　　意義：可在短時間內較經濟、簡便地篩選出批量供試品的細胞毒性，它為動物試驗的進行與否提供了先決條件，對新型醫療器械及生物材料的研制和應用提供了重要保證。

體外細胞毒性試驗方法:

　　體外細胞毒性試驗具有通用性，可以適用于各種醫療器械和生物材料的評價，GB/16886.5標準不是規定一個單一的試驗方法，而是規定一個試驗方案，需要在一系列試驗步驟中判斷，以選出最合適的試驗，試驗主要分三類：浸提液試驗，直接接觸試驗和間接接觸試驗（瓊脂擴散試驗和濾膜擴散試驗)。

　　由于醫療器械產品和材料的多樣性，植入機體環境中的變異性，與機體相互作用的復雜性等因素，選擇郎種方法進行體外細胞毒性評價，不同的試驗人員會有不同的選擇。當一個評價項目具有多個試驗方法時，應考慮試驗的原理、靈敏性、可選性、可定量性、重現性、試驗材料的適用性及局限性等因素進行選擇。

　　例如浸提液法適合檢測溶出物的毒性；直接接觸法對材料的細胞毒性敏感性最高，可檢測出材料微弱的細胞毒性，間接接觸法中的瓊脂擴散試驗適合于毒性大的大批量材料篩選，濾膜擴散法適合于小分子量毒性材料的評價。

　　以上各種方法因原理不同，各有特點，應根據試驗材料本身理化性質、毒性作用強弱及其用途，正確地選擇試驗方法。

MTT法：

將配制好的1×105/mL細胞懸液接種于96孔板，設空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組，每組各設至少6孔，每孔接種100uL細胞懸液，置CO2培養箱（含體積分數5%二氧化碳氣體）37℃培養24h。

培養24h后棄去原培養液，空白對照組加入新鮮細胞培養液，陰性對照組加入陰性對照品浸提液，陽性對照組加入陽性對照溶液或陽性對照品浸提液，供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液（100%、75%、50%、25%），置CO2培養箱繼續培養24h。

更換培養液24h后，置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入50uL質量濃度為1mg/mL的MTT溶液，繼續培養2h后棄去孔內液體，加入100uL異丙醇，置振蕩器上振蕩，在酶標儀570nm和650nm波長下測定吸光度，計算相對增殖率（RGR）。

直接接觸法:

將已培養 48h～72h 生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養液，用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數，將細胞懸液配制成密度 1.0×105/mL，接種于直徑 35mm 培養皿，每皿 2mL，共 9 皿。置 CO2培養箱 （5%CO2，37℃，＞90%濕度）培養至近匯合單層細胞形成。 

棄去原培養液。加入 2mL 新鮮培養基，在培養皿中央部位的細胞層上輕輕放置一片供試樣品，共 3 皿。 同法操作陰性對照、陽性對照各 3 皿。置 CO2培養箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）繼續培養 24h。 

培養結束后，于顯微鏡下觀察細胞形態、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化，根據以下標準判斷試驗樣品分級，分級大于 2 級時被認為有細胞毒性作用。

瓊脂擴散法:

將已培養48h～72h生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養液，用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數，將細胞懸液配制成密度1.0×105/mL，接種于直徑35mm培養皿，每皿2mL，共9皿。置CO2培養箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）培養至近匯合單層細胞形成。

棄去器皿中的培養基，將溶化瓊脂與含血清的新鮮培養基混合,使瓊脂最終質量濃度為0.5%～2%,并吸取適宜體積加入至每只培養皿內。細胞培養只能使用適合于哺乳動物細胞生長的瓊脂。這種瓊脂/培養基的混合物宜為液態,并且溫度適合于哺乳動物細胞。加入2mL中性紅液并在CO2培養箱孵育30min，孵育后丟棄多余的中性紅液，將試驗樣品的平行試樣小心地放在每只培養皿的固化瓊脂層上,確保試樣覆蓋細胞層表面約十分之一，共3皿。同法操作陰性對照、陽性對照各3皿。置CO2培養箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）繼續培養24h。 

培養結束后，將培養皿上的試樣小心地從固化瓊脂層取下，于顯微鏡下觀察培養皿中細胞形態、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化，根據表1判斷試驗樣品分級，分級大于2級時被認為有細胞毒性作用。